Inhalt:
PRAKTISCHE TIPPS
Full Service Proben
Plasmide
Wir empfehlen, Plasmide im Escherichia coli Stamm DH5a zu vermehren. Anschließend sollte die DNA mit Säulen (z.B. QiaTip Mini, Qiagen) aufgereinigt werden. Wir benötigen etwa 500 ng DNA je Sequenzierung, da wir eine Dialyse und eine Konzentrationsbestimmung Ihrer Proben durchführen.
PCR Fragmente
Ein Versand nicht aufgereinigter PCR Fragmente per Post ist nicht empfehlenswert. Die mögliche Restaktivität der Taq DNA Polymerase beeinträchtigt die Templatequalität. Wir empfehlen eine Aufreinigung der PCR Fragmente mit handelsüblichen Säulen. Wichtig ist eine effiziente Abtrennung der PCR Primer, da diese das Sequenzierergebnis beeinträchtigen. Störend wirken sich auch Primerdimere aus. Benötigt werden etwa 10 - 100 ng DNA je Sequenzierung, abhängig von der Größe des PCR-Fragments. Gerne übernehmen wir für Sie die PCR Reaktion und die Aufreinigung des PCR Fragmentes.
Primer
- Falls Sie zur Sequenzierung universelle Primer benötigen sollten, so stellen wir Ihnen diese kostenlos zur Verfügung. Hier können Sie die Primerliste zur DNA-Sequenzierung herunterladen (Excel-Dateil)
- Sequenzspezifische Primer sind vom Kunden zu stellen. Sind Primer nicht vorhanden, so verweisen wir auf unseren DNA-Synthese-Service
Ihr Primer sollte etwa 18 - 20 Nukleotide lang sein. Optimal sind Primer, die eine gleichmäßige Verteilung von G, A, T, und C aufweisen. Längere Wiederholungen von Nukleotiden sollten vermieden werden. Palindrome sollten sich, wenn überhaupt, nicht im 3' Bereich des Primers befinden. Wegen der stabileren Paarung des terminalen Nukleotids kann die DNA Polymerase eine Sequenzierreaktion effizienter starten, wenn ein Primer am 3' Ende ein G oder C trägt. Je Sequenzierung werden etwa 10 pmol Primer benötigt. Die Qualität des Primers ist entscheidend für qualitativ hochwertige Sequenzierungen.
Sneak Peek RtS
Welche DNA-Menge setze ich für eine Sneak Peek Sequenzierung ein?
| Template | Große[bp] | Menge [ng] |
|---|---|---|
| Plasmid-DNA | <8000 | 150-300 |
| PCR-Produkte | 100-200 | 1-3 |
| PCR-Produkte | 200-500 | 3-10 |
| PCR-Produkte | 500-1000 | 5-20 |
| PCR-Produkte | 1000-2000 | 10-40 |
| PCR-Produkte | >2000 | 20-50 |
Für RtS-Reaktionen bitte das Volumen zusammen mit dem Primer ( 5pmol ) auf 7µl mit bidest. H2O auffüllen. Bitte verwenden Sie 0.2ml Probengefäße mit flachem Deckel.
Sneak Peek RtL
Welche DNA-Menge setze ich für eine Sneak Peek Sequenzierung ein?
| Template | Große[bp] | Menge [ng] |
|---|---|---|
| Plasmid-DNA | <8000 | 150-300 |
| PCR-Produkte | 100-200 | 1-3 |
| PCR-Produkte | 200-500 | 3-10 |
| PCR-Produkte | 500-1000 | 5-20 |
| PCR-Produkte | 1000-2000 | 10-40 |
| PCR-Produkte | >2000 | 20-50 |
- Es sollten für die Sequenzierreaktion 5 pmol Primer eingesetzt werden
- Wir sequenzieren auf einem ABI 3130xl-Sequencer unter Verwendung des ABI BigDye®Terminator v.3.1 Ready Reaction Sequenziermix. Bitte stimmen Sie Ihre RtL - Sequenzierungen auf diese Vorgabe ab
- Wir empfehlen folgenden Reaktionsansatz für eine Sequenzierungsreaktion
- X µl Template (einzusetzende Menge entnehmen Sie bitte obiger Tabelle)
- 0,5 µl Primer (Stocklösung: 10 pmol)
- 1 µl BigDye®Terminator v.3.1 Ready Reaction Sequenziermix
- 1,5 µl BigDye®Terminator v1.1, v.3.1 5x Sequencing Buffer
- Ad 10 µl mit HPLC-Wasser
Cycling Protokoll
- 25 Zyklen à
- 96°C 10 sec
- 50°C 5 sec
- 60°C 4 min
Nach dem Ende der Cycle Sequencing Reaktion sollten die Proben bei 4°C gelagert werden, sofern sie nicht sofort weiterverarbeitet (gefällt) werden.
- Wir empfehlen folgendes Protokoll zur Fällung der Sequenzierprobe:
- 10µl Sequenzierprobe
- 10µl HPLC-Wasser
- 2µl 3M NaAc (pH 4,6)
- 50µl EtOH p.a. (96%)
- vortexen, für 15 min bei Zimmertemperatur inkubieren
- bei 13 000 rpm für 11 min bei Zimmertemperatur zentrifugieren
- Überstand komplett abnehmen und verwerfen
- mit 250µl EtOH (70%) waschen
- bei 13 000 rpm für 5 min bei Zimmertemperatur zentrifugieren
- Überstand komplett abnehmen und verwerfen
- Sediment trocknen
Wichtig: Es darf sich kein Ethanol mehr im Reaktionsgefäss befinden!
RtL-Proben nicht Freitags versenden!
Zusatzinformationen:
FAKTEN
- Preisliste zur DNA-Sequenzierung (pdf-Datei)
- Auftragsformular DNA-Sequenzierung Full Service (rtf-Datei)
- Auftragsformular DNA-Sequenzierung Sneak Peek (rtf-Datei)
- Primerliste DNA-Sequenzierung (Excel-Datei)
- Troubleshooting (PDF-Datei, passwortgeschützt für Kunden)