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AUSGANGSMATERIALIEN

Plasmide

Wir empfehlen Plasmide im Escherichia coli Stamm DH5α zu vermehren. Anschließend sollte die DNA mit Säulen (z.B. QiaTip Mini, Qiagen) aufgereinigt werden. Wir benötigen etwa 2 μg DNA je Sequenzierung, da wir eine gelelektrophoretische Konzentrationsbestimmung durchführen. PCR Fragmente Ein Versand nicht aufgereinigter PCR Fragmente per Post ist nicht empfehlenswert. Die mögliche Restaktivität der Taq DNA Polymerase beeinträchtigt die Templatequalität. Wir empfehlen eine Aufreinigung der PCR Fragmente mit handelsüblichen Säulen. Wichtig ist eine effiziente Abtrennung der PCR Primer, da diese das Sequenzierergebnis beeinträchtigen. Störend wirken sich auch Primerdimere aus. Benötigt werden etwa 0,5 μg DNA je Sequenzierung. Gern übernehmen wir für Sie die PCR Reaktion und die Aufreinigung des PCR Fragmentes.

Primer

  • Falls Sie zur Sequenzierung universelle Primer benötigen sollten, so können wir diese kostenlos zur Verfügung stellen. Hier können Sie die Primerliste zur DNA-Sequenzierung herunterladen (Excel-Dateil).
  • Sequenzspezifische Primer sind vom Kunden zu stellen. Sind Primer nicht vorhanden, so verweisen wir auf unseren DNA-Synthese-Service.

Ihr Primer sollte etwa 18 - 20 Nukleotide lang sein. Optimal sind Primer, die eine gleichmäßige Verteilung von G, A, T, und C aufweisen. Längere Wiederholungen von Nukleotiden sollten vermieden werden. Palindrome sollten sich, wenn überhaupt, nicht im 3‘ Bereich des Primers befinden. Wegen der stabileren Paarung des terminalen Nukleotids kann die DNA Polymerase eine Sequenzierreaktion effizienter starten, wenn ein Primer am 3‘ Ende ein G oder C trägt. Je Sequenzierung werden etwa 10 pmol Primer benötigt. Die Qualität des Primers ist entscheidend für qualitativ hochwertige Sequenzierungen.

Zusatzinformationen:

FAKTEN